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新冠疫情爆發(fā)以來(lái)，如何快速高效檢測(cè)出新冠病毒成了全球關(guān)注的焦點(diǎn)。雖然基于血清學(xué)的檢測(cè)快速且僅需要少量的設(shè)備，但由于患者可能在癥狀發(fā)作之后的數(shù)天甚至數(shù)周才會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)的抗體，所以其實(shí)用性有限。而目前全球大量科研團(tuán)隊(duì)都在研究和開(kāi)發(fā)基于CRISPR-Cas9的新冠病毒檢測(cè)技術(shù)，竟然和早孕測(cè)試差不多？
?一、CRISPR技術(shù)簡(jiǎn)介
CRISPR-Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，可用來(lái)對(duì)抗入侵的病毒降解外源 DNA。該系統(tǒng)由 Cas9核酸酶和確定靶向序列的RNA復(fù)合體組成，后者由 crRNA和反式激活 RNA(tracrRNA) 組成。?
二、CRISPR技術(shù)的應(yīng)用
在 實(shí) 際 應(yīng) 用 中，crRNA 和 TracrRNA 可以融合成為一條 RNA( sgRNA) 發(fā)揮功能。簡(jiǎn)化后的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)由兩部分組成: Cas9 蛋白和 sgRNA。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)展徹底改變了人們編輯 DNA 序列和調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)水平的能力，從而為生物體的精確基因組編輯提供了有力的工具。該系統(tǒng)作用原理為 sgRNA 通過(guò)自身的 Cas9 把手與 Cas9 蛋白形成 Cas9-sgRNA 復(fù)合體，Cas9-sgRNA 復(fù)合體中 sgRNA 的堿基互補(bǔ)配對(duì)區(qū)序列與目標(biāo)基因的靶序列通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行配對(duì)結(jié)合，Cas9 利用自身的核酸內(nèi)切酶活性對(duì)目標(biāo) DNA 序列進(jìn)行切割。目前在研的基于CRISPR-Cas9技術(shù)的SARS-CoV-2檢測(cè)項(xiàng)目如下圖所示。分別是HERLOCK Bioscience開(kāi)發(fā)的SHERLOCK技術(shù)，Mammoth Biosciences開(kāi)發(fā)的DETECTR技術(shù)，康涅尼格大學(xué)研究人員開(kāi)發(fā)的AIOD技術(shù)，加州大學(xué)圣芭芭拉分校研究人員開(kāi)發(fā)的CREST技術(shù)印度CSIR基因及整合生物學(xué)研究所研究人員開(kāi)發(fā)的FELUDA技術(shù)。
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1、SHERLOCK
SHERLOCK是由Sherlock Biosciences和MIT聯(lián)合開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)新冠檢測(cè)技術(shù)，Sherlock Biosciences是2019年3月創(chuàng)立的一家生物技術(shù)公司，該公司由張鋒等9位在CRISPR技術(shù)領(lǐng)域和癌癥、傳染疾病診斷技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)家共同創(chuàng)立，核心技術(shù)由麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)授權(quán)，分別是基于基因編輯技術(shù)CRISPR的診斷技術(shù)平臺(tái)SHERLOCK，和基于合成生物學(xué)的分子診斷平臺(tái)INSPECTR。?2020年2月，張鋒教授和他的合作伙伴宣布開(kāi)發(fā)出一項(xiàng)基于CRISPR的新冠病毒檢測(cè)技術(shù)，不需要復(fù)雜的設(shè)備，三步檢測(cè)僅需約1個(gè)小時(shí)，就能檢查出新冠病毒RNA的存在。SHERLOCK的核心是一種叫做Cas13a的蛋白酶和與其結(jié)合的向?qū)NA。根據(jù)新冠病毒的RNA序列，研究人員們精心設(shè)計(jì)了能夠靶向新冠病毒特異性序列的向?qū)NA。后續(xù)的檢測(cè)步驟與市場(chǎng)上的懷孕檢測(cè)很相似，將反應(yīng)后的樣本滴在能夠識(shí)別“完整分子”和“切斷分子”的試紙上，如果樣本里不存在新冠病毒，那么試紙標(biāo)識(shí)“完整分子”的較低位置上，就會(huì)出現(xiàn)一條條帶。相反，如果樣本里真的有新冠病毒對(duì)應(yīng)的RNA，那么在代表“切斷分子”的較高位置上，會(huì)出現(xiàn)另一條條帶。通過(guò)條帶位置的不同，我們很容易就能確認(rèn)新冠病毒的存在與否。?該團(tuán)隊(duì)在2020年5月發(fā)布了一個(gè)更新的檢測(cè)方法：一步 STOPCovid，這款最新的檢測(cè)手段比2月份的檢測(cè)技術(shù)更進(jìn)一步，檢測(cè)過(guò)程中不需要從患者樣本中純化RNA，并且將檢測(cè)新冠病毒所需的化學(xué)反應(yīng)步驟在一個(gè)試管中完成。在檢驗(yàn)12個(gè)新冠病毒陽(yáng)性和5個(gè)新冠病毒陰性樣本的實(shí)驗(yàn)中，這一檢測(cè)達(dá)到100%的特異性和97%的靈敏度。不過(guò)科學(xué)家們也強(qiáng)調(diào)，這一檢測(cè)方法還沒(méi)有獲得FDA的批準(zhǔn)，尚不能用于臨床上對(duì)新冠病毒感染的診斷。一步 STOPCovid 試驗(yàn)示意圖：
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該團(tuán)隊(duì)還進(jìn)一步設(shè)計(jì)了可用于讀取 STOPCovid 試驗(yàn)結(jié)果的設(shè)備盒：取樣至反應(yīng)管，將密封的反應(yīng)管置于檢測(cè)盒，用戶關(guān)閉檢測(cè)盒并拉動(dòng)手柄，樣本在側(cè)向?qū)游鰲l上發(fā)生反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用手機(jī)APP獲取條帶定量強(qiáng)度和相應(yīng)測(cè)試結(jié)果。? ? ? ?
該方法的優(yōu)點(diǎn)在于：在 crRNA/靶基因復(fù)合體中存在兩個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配的情況下，Cas13a 不具有催化活性，所以對(duì)于高度相似的病毒不會(huì)給出陽(yáng)性結(jié)果。與DETECTR所使用的 Cas12a 不同，Cas13a 對(duì)靶位點(diǎn)沒(méi)有嚴(yán)格的序列偏好，而 Cas12a 需要 PAM進(jìn)行靶標(biāo)切割，限制了使用范圍。2020 年 5 月 7 日，Sherlock Biosciences宣布其已獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 對(duì)其 Sherlock?CRISPR新冠病毒試劑盒的緊急使用授權(quán) (EUA)，該試劑盒用于檢測(cè)引起 COVID-19 的病毒，在大約一小時(shí)內(nèi)提供結(jié)果。?2、 DETECTR 新冠病毒
DETECTR是由Mammoth Biosciences和UCSF聯(lián)合開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)新冠檢測(cè)技術(shù)，Mammoth Biosciences是一家美國(guó)生物技術(shù)公司，它由CRISPR大神Jennifer Doudna創(chuàng)辦，該公司的目標(biāo)是使其CRISPR驅(qū)動(dòng)的搜索引擎成為疾病檢測(cè)的首選平臺(tái)。2020年四月，根據(jù)發(fā)表在《自然-生物技術(shù)》的一篇研究論文顯示，Mammoth Biosciences和加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的科研團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)發(fā)出一種基于CRISPR技術(shù)的診斷工具，可以快速檢測(cè)出患者體內(nèi)是否有新冠病毒。論文指出，使用這一技術(shù)大約只需45分鐘就能給出結(jié)果，相比之下，目前基于PCR的核酸檢測(cè)需要幾小時(shí)甚至幾天才能出結(jié)果，因此新技術(shù)可以大大縮短診斷時(shí)間。其檢測(cè)步驟和原理如下圖所示：
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在檢測(cè)的 83 份已知 COVID 陽(yáng)性樣本中，DETECTR 的陽(yáng)性預(yù)測(cè)率為 95%，陰性預(yù)測(cè)率為 100%。它也是迄今檢測(cè)速度最快的測(cè)方法。此法需要進(jìn)行RNA的提取，Lucia等研究人員對(duì)類(lèi)似的方法進(jìn)行了優(yōu)化，可直接使用唾液檢測(cè)新冠病毒病毒，無(wú)需進(jìn)行 RNA 提取，但僅當(dāng)唾液中病毒載量足夠高（105 拷貝/μl）時(shí)才可能起作用。Mammoth Biosciences日前表示正在與GSK Consumer Healthcare合作，一起將其基于CRISPR的DETECTR平臺(tái)設(shè)計(jì)和制造成一次性家庭測(cè)試套件，該套件制造計(jì)劃在2020年底前完成。并在今年年底之前將向美國(guó)FDA遞交緊急使用授權(quán)（EUA）的申請(qǐng)。
?3、AIOD
該技術(shù)是由康涅尼格大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的Changchun Liu教授團(tuán)隊(duì)發(fā)明。其檢測(cè)步驟和原理如下：
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該方法與 SHERLOCK 診斷檢測(cè)高度相似，在步驟的順序和使用的 Cas 蛋白方面存在差異。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)時(shí)反應(yīng)所需的所有組分混合放置于同一反應(yīng)體系中，并在單一溫度下孵育。本檢測(cè)方法中設(shè)計(jì)了兩個(gè) Cas12a-crRNA 復(fù)合物，使用兩個(gè)與兩個(gè)區(qū)域結(jié)合的 crRNAs 提高了檢測(cè)的靈敏度。且該反應(yīng)不受 Cas12a 的前間隔區(qū)相鄰基序 (PAM) 的限制。該體系具有接近單分子水平的敏感性。以 HIV-1 和新冠病毒檢測(cè)為例，未經(jīng)預(yù)擴(kuò)增的 AIOD檢測(cè)體系能夠在 40 min 的孵育中檢測(cè)低至 1.2 拷貝的 DNA 靶標(biāo)和 4.6 拷貝的 RNA 靶標(biāo)。
4、CREST?該技術(shù)是由加州大學(xué)圣芭芭拉分校分子細(xì)胞生物學(xué)系的Max Wilson，Diego Acosta-Alvear, Carolina Arias教授團(tuán)隊(duì)共同發(fā)明。其檢測(cè)步驟和原理如下：
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該技術(shù)使用PCR擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄 RNA 樣本，本檢測(cè)方法沒(méi)有使用典型的 PCR 儀，而是使用以電池供電通過(guò)藍(lán)牙即可以啟用的簡(jiǎn)易PCR 儀。
?5、 FELUDA?
該技術(shù)是由印度CSIR基因及整合生物學(xué)研究所的Souvik Maiti 和Debojyoti Chakraborty研究員共同開(kāi)發(fā)。FELUDA是一種基于FnCas9 的CRISPR技術(shù)，F(xiàn)nCas9 是一種對(duì) DNA 內(nèi)是否存在錯(cuò)配以及這些錯(cuò)配的位置高度敏感的蛋白。當(dāng)存在兩個(gè)及以上的堿基錯(cuò)配時(shí)， FnCas9 將不會(huì)對(duì)靶基因序列進(jìn)行切割。其檢測(cè)步驟和原理如下：
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該方法依賴于其對(duì)目標(biāo)區(qū)域的活性，F(xiàn)nCas9 可在 10-50 ℃ 之間變化的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行切割。
?6、五種檢測(cè)方法比較：?
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結(jié)語(yǔ)
在以往的大流行病中，缺乏快速、便捷和準(zhǔn)確的診斷測(cè)試技術(shù)，是阻礙公共衛(wèi)生部門(mén)應(yīng)對(duì)和控制新出現(xiàn)的病毒威脅的主要原因之一。如何開(kāi)發(fā)具有經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，快速便捷特性的診斷工具，成為我們應(yīng)對(duì)當(dāng)下正在流行的COVID-19和未來(lái)可能突發(fā)的公共衛(wèi)生事件的決勝步驟。基于CRISPR的診斷工具由于其具有準(zhǔn)確便捷迅速的特點(diǎn)，可以在幾天內(nèi)進(jìn)行重新配置以檢測(cè)目標(biāo)病毒。針對(duì)這一技術(shù)開(kāi)發(fā)的診斷方法很有可能會(huì)改變以前流行病學(xué)檢測(cè)的方法。
