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【CMDE】幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變檢測試劑盒（熒光 PCR 法）審評報告公開

日期:2022-02-24

受理號：CSZ1900183

體外診斷試劑產品注冊技術審評報告

產品中文名稱：幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

產品管理類別：第三類

申請人名稱：江蘇默樂生物科技股份有限公司

國家藥品監督管理局

醫療器械技術審評中心

基本信息

一、申請人名稱

江蘇默樂生物科技股份有限公司

二、申請人住所

江蘇省泰州市健康大道 805 號 G116 幢 6F-7F 東

三、生產地址

泰州市藥城大道 G02 廠房，R19 樓；江蘇省泰州市健康大道 805 號 G116 幢 6F、7F 東

技術審評概述

一、產品概述

（一）產品主要組成成分

檢測緩沖液、引物探針、混合酶液、強陽性質控品、弱陽性質控品、陰性質控品。（具體詳見說明書）

（二）產品預期用途

用于檢測人胃黏膜組織樣本中幽門螺桿菌 23S rRNA 基因A2143G、A2143C 和 A2144G 突變和 gyrA 基因 261A、261G、260T、271A、271T、272G 突變。

本試劑盒用于幽門螺桿菌克拉霉素耐藥（23S rRNA 基因突變）和喹諾酮類抗生素耐藥（gyrA 基因突變）的臨床輔助診斷，為臨床醫生評估個體中幽門螺桿菌的耐藥性提供參考。試劑盒適用于幽門螺桿菌感染者且臨床認為有必要采用胃粘膜組織進行幽門螺桿菌耐藥診斷的患者。未與具體藥品進行相關臨床試驗，本試劑盒檢測結果僅供臨床參考，不得作為確診或排除的唯一依據。

（三）產品包裝規格

50 測試/盒

（四）產品檢驗原理

采用聚合酶鏈式反應（PCR）結合Taqman熒光探針技術對人胃黏膜組織樣本中的幽門螺桿菌及耐藥突變的鑒別檢測。針對幽門螺桿菌克拉霉素耐藥基因（23S rRNA基因）與喹諾酮類抗生素耐藥基因（gyrA基因）的突變位點設計引物探針，采用FAM熒光標記克拉霉素耐藥基因突變，采用HEX熒光標記喹諾酮類抗生素耐藥基因突變。包含與克拉霉素耐藥相關的23SrRNA基因的3種突變和與喹諾酮類抗生素耐藥相關的gyrA基因的6種突變

二、臨床前研究概述

（一）主要原材料

本產品的主要原材料包括：引物、探針、HS Taq DNA 聚合酶、UNG 酶、dNTPs、質粒等，這些原材料均通過外購的方式獲得。引物和探針均由申請人自行設計后，由專業的合成公司合成。申請人對主要原材料進行了供應商的選擇，通過功能性實驗篩選出合格供應商，制定了各主要原材料的技術要求和質量標準并經檢驗合格。

企業參考品設置情況：申請人設計了完整的企業參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、最低檢測限參考品、精密度參考品以及突變檢測限參考品。企業參考品的主要原料為幽門螺桿菌菌液、臨床樣本核酸、質粒等。參考品組成如下：

Hp 陽性參考品 10 份；Hp 陰性參考品 10 份；包含所有位點的最低檢測限參考品 30 份；Hp 精密度參考品 1 份；突變檢測限參考品 18 份。以上企業參考品均含有一定濃度的人類基因組DNA 作為內標。

企業參考品所采用臨床樣本采用基因測序的方法進行確認。企業參考品用于產品特異性、靈敏度、最低檢測限、精密度及突變檢測限檢測。

（二）生產工藝及反應體系研究

申請人根據試劑盒中試劑及成分的主要生產工藝研究結果，確定了最佳的生產工藝。試劑盒反應體系的研究中，包含了臨床樣本的核酸提取與 PCR 擴增反應等。其中核酸提取研究包括核酸純度、核酸完整性、重復性以及取樣部位、取樣大小等。PCR 擴增的反應體系研究包括引物探針濃度、dNTPs 濃度、DNA 聚合酶濃度、鎂離子濃度、BSA 濃度、丙三醇濃度以及PCR反應程序優化等。通過一系列功能性實驗，最終確定了最佳的反應體系。

（三）分析性能評估

該產品分析性能包括靈敏度、準確度、特異性（交叉反應、干擾物質）、精密度等。此外，還研究了配套使用的核酸提取試劑的性能。申請人提交了有效運行的質量管理體系下生產的三批產品在適用機型 ABI7500 熒光 PCR 儀與上海宏石SLAN-96P 上進行的性能評估資料。

在靈敏度的性能評估中，進行了最低檢測限與突變率檢測限的確定和驗證。

最低檢測限的確定和驗證：申請人采用臨床樣本培養物對每個突變位點分別建立檢出限。選取分別具有 23S rRNA 基因2143C、2143G 和 2144G，gyrA 基因 261G、261A、260T、271A、271T 和 272G 突變的菌液，每種突變菌株分別稀釋至不同濃度，使用 3 批試劑對每一濃度重復檢測 20 次，以此確定試劑盒的最低檢出限，結果顯示：具有 95%以上陽性檢出率的樣本濃度均不高于 1×104copies/mL。申請人進一步選取 10 例具有不同突變類型的臨床培養物，并使用幽門螺桿菌陰性樣本稀釋至1×104copies/mL，在稀釋物中添加不同干擾物質后再檢測，結果顯示，在存在干擾物質的情況下，試劑盒的最低檢出限仍然為1×104copies/mL。

突變檢測限的確定和驗證：申請人將不同濃度、具有不同突變類型的核酸與野生核酸按照不同比例進行混合。核酸濃度為 1pg/μL 時，設置突變比例分別為 10%、0.1%和 0.001%，濃度為 0.001pg/μL 時，設置突變比例為 80%、50%和 10%。每種混合核酸均進行 20 次重復，結果顯示，當野生型幽門螺桿菌濃度為 1pg/μL，各突變位點具有 90%以上陽性檢出率的最低突變比例為 0.1%；當野生幽門螺桿菌濃度為 0.001pg/μL，各突變位點具有 90%以上陽性檢出率的最低占比為 50%。申請人進一步將經測序方法驗證過的、具有不同突變類型的核酸與野生型核酸混合按照一定比例混合后進行檢測，用以驗證突變檢測限。

結果顯示：當野生型幽門螺桿菌濃度為 1pg/μL，0.1%突變比例條件下，各突變位點均能 100%檢出；當野生幽門螺桿菌濃度為0.001pg/μL，50%突變比例條件下，各突變位點均能 100%檢出。在準確度的性能評估中，使用 3 批試劑對企業陽性參考品和陰性參考品進行檢測。檢測結果表明，陽性符合率和陰性符合率均為 100%。

在交叉反應的性能評估中，使用 3 批試劑檢測胃腸道常見的其他病原微生物，如蠟樣芽孢桿菌、肺炎克雷伯桿菌肺炎、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、類志賀鄰單胞菌、流感嗜血桿菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、腦膜炎奈瑟菌、結核分枝桿菌、大腸桿菌、空腸彎曲菌、變形桿菌、白色念珠菌、糞腸球菌等，檢測結果均為陰性。

在干擾物質的性能評估中，采用向弱陽性樣本中加入干擾物質的方法進行驗證，實驗結果顯示，常見干擾物質如血紅蛋白（1000.0 mg/L）、粘蛋白（2000.0 mg/L）、白細胞（109個/L）、阿莫西林（0.75mg/L）、克拉霉素（0.29mg/L）、左氧氟沙星（1.62mg/L）、四環素（5.0mg/L）、甲硝唑（40.0mg/L）、奧美拉唑（0.4mg/L）、雷貝拉唑（0.802mg/L）、蘭索拉唑（1.15mg/L）、泮托拉唑（3.81mg/L）、枸櫞酸鉍鉀（67.85mg/L）、阿司匹林（ 300.0mg/L ）、對乙酰氨基酚（ 13.824mg/L ）、鋁碳酸鎂（1500.0mg/L）、乳酸菌素（3600.0mg/L）和胃康靈（100.0mg/L）等在上述濃度時對本試劑的檢測結果沒有影響。

在精密度的性能評估中，選擇 10 例具有不同突變類型的樣本，并稀釋至不同濃度，在 20 天內，每天由 2 人分別進行 2個輪次的檢測，每一次檢測做 3 個重復。檢測結果顯示：批內、批間、日內、日間、儀器間以及操作者間的變異系數 CV 均小于 5%。

本次申報產品包括 1 種包裝規格（50 測試/盒），2 種實時熒光定量 PCR 儀適用機型（ABI7500 與上海宏石 SLAN-96P），申請人提供了三批產品在適用機型上的性能評估資料。

（四）陽性判斷值研究

申請人選取胃粘膜組織臨床樣本，包含 23S rRNA 基因2143C/2143G/2144G 和 gyrA 基因 261G/261A/260T/271A/271T/272G 不同突變的樣本，對檢測結果進行 ROC 曲線分析，結果顯示：幽門螺桿菌克拉霉素耐藥基因突變檢測 FAM 熒光 Ct 值的參考值為 35.04；幽門螺桿菌喹諾酮類抗生素耐藥基因突變HEX 熒光 Ct 值的參考值為 35.73。本試劑盒使用人源基因作為試劑盒內標，確定內標 CY5 熒光 Ct 值的參考值為 32.00。同時，將本試劑盒檢測結果進一步與臨床培養藥敏實驗結果進行了比較，驗證了試劑陽性判斷值的合理性。

（五）穩定性研究

申請人對本產品的實時穩定性、運輸穩定性、開瓶穩定性、凍融穩定性、胃黏膜組織樣本的穩定性以及核酸的穩定性進行了研究，確定了在各種條件下本產品及樣本的有效保存時間。

實時穩定性的研究：采用三批試劑進行研究，將本試劑盒避光密閉保存在-20±5℃條件下，分別在第 0、1、2、3、6、9、12、13 月取出檢測，檢測的樣本類型包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、精密度參考品等企業參考品，以從準確度、特異性、檢測限、精密度等方面綜合驗證試劑盒的穩定程度。檢測結果表明，各項性能指標均符合要求，確定產品在規定的儲存條件下，可穩定保存 12 個月。

此外，申請人對產品的運輸穩定性、開瓶穩定性、凍融穩定性、樣本及核酸穩定性分別進行了研究。結果顯示，產品的性能均滿足產品說明書的聲稱。

三、臨床評價概述

申請人在南昌大學第一附屬醫院、南方醫科大學南方醫院、湖州市中心醫院、山西省人民醫院和四川大學華西醫院共 5 家臨床試驗機構完成了臨床試驗。

臨床試驗主要包括兩部分內容：第一部分，采用試驗用體外診斷試劑與幽門螺桿菌克拉霉素和喹諾酮類抗生素體外藥敏實驗（E-test）進行比較研究，共計入組 801 例幽門螺桿菌感染受試者樣本（幽門螺桿菌培養陽性），其中藥敏實驗檢出克拉霉素耐藥菌株 562 例，克拉霉素敏感菌株 239 例，研究結果顯示，試驗用體外診斷試劑臨床靈敏度是 91.81%（95%CI: 89.25%～93.81%），臨床特異度是 80.33%（95%CI：74.83%～84.88%）。藥敏實驗檢出喹諾酮類抗生素耐藥菌株 532 例，喹諾酮類抗生素敏感菌株 269 例，試驗用體外診斷試劑臨床靈敏度是 84.96%（95%CI：81.67%～87.75%），臨床特異度是 82.16%（95%CI：77.14%～86.27%）。試驗還對所有突變位點進行了單獨統計，各位點與藥敏結果符合率良好，且滿足統計學意義。

第二部分，采用試驗用體外診斷試劑與 Sanger 測序法進行對比試驗。共計入組樣本 1786 例，其中，測序檢出 23S rRNA基因的 3 種常見突變陽性 813 例，突變陰性 973 例，兩種方法的陽性符合率為 94.10%（95%CI：92.26%～95.52%），陰性符合率為 96.71%（95%CI：95.39%～97.66%），總符合率為 95.52%（95%CI：94.46%～96.39%）；測序檢出 gyrA 基因的 6 種常見突變陽性 675 例，突變陰性 1111 例，兩種方法的陽性符合率為93.48%（95%CI：91.36%～95.11%)，陰性符合率為 94.42%（95%CI：92.91%～95.62%），總符合率為 94.06%（95%CI：92.87%～95.07%）。考核試劑與 Sanger 測序法一致性良好。

綜上，臨床試驗結果顯示，本產品檢測結果用于幽門螺桿菌克拉霉素和喹諾酮類抗生素耐藥的輔助診斷，靈敏度、特異度良好，基本滿足臨床需求。

四、產品受益風險判定

（一）受益評估

目前認為幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是引起慢性活動性胃炎、十二指腸及胃潰瘍的主要原因。另外，根據目前多方面流行病學調查顯示，發現 Hp 除了與上消化道的慢性炎癥、消化道潰瘍、胃癌等疾病高度相關以外，同時與許多胃腸外疾病的發生、發展有相當密切的關系。

目前對幽門螺桿菌的治療主要采用含有抗生素的三聯或四聯療法進行，而隨著抗生素的大量使用，幽門螺桿菌已經出現了抗生素的耐藥現象，克拉霉素與喹諾酮類抗生素耐藥率在20%-50%之間。《第五次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告》中指出：不論初次治療或補救治療，如需選擇含克拉霉素、甲硝唑或左氧氟沙星的三聯方案，應進行藥物敏感試驗。有研究表明，基于藥敏試驗的多重療法相比于經驗性的用藥，Hp 的根除率從 63%提高至 86%，但培養有一定技術要求，敏感性偏低，因此不推薦單純用于 Hp 感染的常規診斷。我國《第五次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告》指出：分子生物學可用于 Hp 耐藥位點的檢測，并明確認為該方法學對 Hp 耐藥基因突變的檢測具有臨床應用價值。

本試劑檢測幽門螺桿菌感染患者胃粘膜組織樣本中的幽門螺桿菌 23S rRNA 基因兩個多態性位點的三種常見突變 2143C、2143G 和 2144G，gyrA 基因 6 種常見突變 261G、261A、260T、271A、271T 和 272G。用于幽門螺桿菌克拉霉素和喹諾酮類抗生素耐藥的臨床輔助診斷，為臨床醫生評估個體中幽門螺桿菌的耐藥特性提供參考。臨床應用的主要受益在于：對于幽門螺桿菌感染者需要進行克拉霉素和喹諾酮類抗生素藥物敏感性評價的，提供除細菌藥敏試驗外的一種分子生物學方法的選擇。特別是可以彌補幽門螺桿菌培養敏感性不足的問題。幽門螺桿菌陽性可以及時治療，耐藥陽性患者可以避免使用克拉霉素或喹諾酮類抗生素治療導致的失敗，從而提高幽門螺桿菌的根除率。經臨床評價，該產品對克拉霉素耐藥幽門螺桿菌菌株感染患者的檢出靈敏度是 94.10%，對喹諾酮類抗生素耐藥幽門螺桿菌菌株感染患者的檢出靈敏度是 93.48%。

（二）風險評估

該產品主要的風險來自于檢測存在假陰性情況，如對克拉霉素耐藥幽門螺桿菌菌株感染患者檢測結果為陰性，則可能導致患者使用克拉霉素進行治療，進一步導致治療失敗，經臨床研究，本檢測假陰性的概率是 5.90%。如對喹諾酮類抗生素幽門螺桿菌菌株感染患者檢測結果為陰性，則可能導致患者使用喹諾酮類抗生素進行治療，進一步導致治療失敗，經臨床研究，本檢測假陰性的概率是 6.52%。

（三）風險收益評價結論

根據申請人提供的申報資料，經綜合評價，在目前認知水平上，認為該產品能夠較大程度地滿足醫療需求，預期為適用人群帶來的受益大于風險。但為保證用械安全，基于對主要剩余風險的規避，需在說明書中提示以下信息：采用本試劑盒進行檢驗得到的結果僅供臨床參考，不作為治療或其它臨床管理的唯一依據。

綜合評價意見

本申報項目為境內第三類醫療器械產品注冊，屬于境內同品種首個產品。申請人的注冊申報資料符合現行要求，依據《醫療器械監督管理條例》（國務院令第 680 號）、《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令 2014 年第 5 號）等相關醫療器械法規與配套規章，經系統評價后，建議準予注冊。

2022 年 1 月 24 日

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【CMDE】幽門螺桿菌 23S rRNA 基因與 gyrA 基因突變檢測試劑盒（熒光 PCR 法）審評報告公開