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分子診斷三大經(jīng)典技術(shù)：qPCR、NGS、數(shù)字PCR！

日期:2022-05-17

分子診斷是將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于疾病診斷的醫(yī)學(xué)分支學(xué)科，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究人體內(nèi)源性或外源性生物分子的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控變化，為疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷、治療、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)。精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，將持續(xù)推動(dòng)分子診斷的進(jìn)步。目前常見(jiàn)核酸分子診斷技術(shù)涉及三個(gè)技術(shù)：熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）、高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）和數(shù)字PCR。如何選擇，我們作一下簡(jiǎn)要介紹。

qPCR

在1983年，美國(guó)人Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction, PCR),這一技術(shù)將DNA的變性原理以及復(fù)性原理加以利用，采用適溫延伸、高溫變性以及低溫復(fù)性，讓核酸片段實(shí)現(xiàn)了體外擴(kuò)增，可將極微量的目標(biāo)DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍，從而提高對(duì)DNA分子的分析和檢測(cè)，因?yàn)镻CR有著很高的靈敏度以及特異性，而且簡(jiǎn)便快速，所以這種技術(shù)已經(jīng)成為目前臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室接受程度最高的技術(shù)。

qPCR通過(guò)熒光染料或熒光特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有熒光染料分子結(jié)合到雙鏈DNA上或有熒光分子從探針上釋放，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的累積。由于熒光積累與PCR產(chǎn)物形成完全同步，可通過(guò)軟件對(duì)熒光積累信息進(jìn)行分析和計(jì)算，獲得待測(cè)樣品模板的初始濃度。但是，qPCR只能夠通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)定量，無(wú)法做到精準(zhǔn)絕對(duì)定量。

NGS

基因測(cè)序是直接獲得核酸序列信息的唯一技術(shù)手段,是分子診斷技術(shù)的一項(xiàng)重要分支。雖然分子雜交、分子構(gòu)象變異或定量PCR技術(shù)在近幾年已得到了長(zhǎng)足的發(fā)展,但其對(duì)于核酸的鑒定都僅僅停留在間接推斷的假設(shè)上,因此對(duì)基于特定基因序列檢測(cè)的分子診斷,核酸測(cè)序仍是技術(shù)上的金標(biāo)準(zhǔn)。

NGS可以一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定。在基因組水平上，NGS可進(jìn)行從頭測(cè)序而獲得該物種的全長(zhǎng)序列，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)；對(duì)已知參考序列的物種，進(jìn)行全基因組重測(cè)序可檢測(cè)新的突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異的分子基礎(chǔ)。在轉(zhuǎn)錄組水平上，NGS可進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，開(kāi)展可變剪接、基因表達(dá)差異、新非編碼RNA分子發(fā)現(xiàn)等研究。

NGS與染色質(zhì)免疫共沉淀和甲基化DNA免疫共沉淀技術(shù)相結(jié)合，可檢測(cè)出與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點(diǎn)。NGS功能強(qiáng)大，適合用于探索篩選新的生物標(biāo)志物，但是實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜，數(shù)據(jù)分析難度較大，檢測(cè)周期長(zhǎng)，成本較高。

數(shù)字PCR

數(shù)字PCR是新興起來(lái)的一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。該技術(shù)可直接獲得DNA分子的拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)起始樣品中核酸分子的絕對(duì)定量，且無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)。數(shù)字PCR已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，如拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、復(fù)雜來(lái)源樣品中低豐度核酸分子檢測(cè)、NGS數(shù)據(jù)驗(yàn)證、miRNA等微小差異表達(dá)研究、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等方面，在已知突變的癌癥分子標(biāo)志物的檢測(cè)、傳染病病原體檢測(cè)、基因組三倍體分析和基因表達(dá)分析等領(lǐng)域展現(xiàn)了強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。

總結(jié)

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大家會(huì)有疑問(wèn)：選擇哪種檢測(cè)技術(shù)才能更好的達(dá)到預(yù)期結(jié)果？通過(guò)突變檢測(cè)限、定量能力、操作簡(jiǎn)易程度、檢測(cè)費(fèi)用、適用場(chǎng)所、發(fā)現(xiàn)未知序列等方面進(jìn)行比較，您或許會(huì)有自己的答案。

從上表來(lái)看，數(shù)字PCR因?yàn)殪`敏度高、絕對(duì)定量、適合于醫(yī)院操作等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤液體活檢、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查、感染性疾病早期診斷等臨床檢測(cè)應(yīng)用方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。NGS在檢測(cè)未知序列、未知突變、高通量多位點(diǎn)檢測(cè)方面是更好的選擇，是科研和獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室服務(wù)的好工具。qPCR適用于較常規(guī)的臨床分子診斷項(xiàng)目。

總的來(lái)看，分子診斷技術(shù)的應(yīng)用不僅深化對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，而且不斷擴(kuò)大了分子診斷疾病的病種，隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成和蛋白質(zhì)組計(jì)劃的啟動(dòng)，分子診斷方法將極大地推動(dòng)現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，并通過(guò)這些基本技術(shù)的衍生、聯(lián)合產(chǎn)生新的分析方法，從而提高分子診斷的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性，為臨床醫(yī)學(xué)診斷和治療提供更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)和信息。

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