新型冠狀病毒（SARS-CoV-2或2019-nCoV）威脅著全球健康，盡管它與SARS-CoV非常相似，但是傳染性卻更大。現(xiàn)有的RT-qPCR檢測方法往往需要昂貴的設備和訓練有素的醫(yī)療器械創(chuàng)新網(wǎng)。在這種情況下，亟需開發(fā)出一種快速、準確且能夠在現(xiàn)場檢測病毒的方法。

2月25日，預印本網(wǎng)站?medRxiv?發(fā)布了分別由沈陽化工大學應用生物學研究所所長尹秀山博士團隊和美國密歇根皇家橡樹博蒙特Michael B Chancellor團隊帶來的報告，揭示了中外科學家通過逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）技術探索出快速檢測病毒的新方法，這兩種方法不僅操作簡單、能在現(xiàn)場使用，并且可以在45分鐘內(nèi)出檢測結果。

RT-LAMP是一種將環(huán)介導等溫擴增（LAMP）以及反轉(zhuǎn)錄相結合，直接檢測出RNA的技術，當它與反應混合物中的pH指示劑耦合時，人們可以通過顏色的變化知道檢測結果。

iLACO可檢測出低至10個拷貝的ORF1ab基因

尹秀山博士團隊開發(fā)出一種經(jīng)過優(yōu)化的、基于恒溫LAMP的檢測方法——iLACO（isothermal LAMP based method forCOVID-19）并對其進行了驗證。

//doi.org/10.1101/2020.02.20.20025874

在研究中，研究人員制備了多個反應物，其中包含合成ORF1ab基因序列的基因稀釋液（從1,000,000到10份拷貝），結果發(fā)現(xiàn)iLACO非常敏感，能夠檢測到低至10份拷貝的ORF1ab基因。為了進一步擴大iLACO的檢測能力，研究人員將新型核酸染料GeneFinderTM添加至反應混合物中，在65℃溫育一段時間后放在藍光下，發(fā)現(xiàn)陽性組肉眼可見明顯的綠色熒光，而陰性組則保持粉色不變。

陽性組和陰性組在藍光下呈現(xiàn)不同顏色

最后，研究人員使用iLACO評估了2020年沈陽市疫情爆發(fā)期間經(jīng)過RT-qPCR初診的43個樣本，結果顯示，97.6%（42/43）經(jīng)qPT-PCR驗證的樣品與2 μl樣本孵育40分鐘后顯示出一致的信號，只有一個樣本在50分鐘后顏色保持不變，表明低劑量病毒會導致假陰性或自發(fā)性陰性信號。

目前，RT-qPCR檢測大多使用5μl樣品輸入，因此研究人員檢測了增加樣本量是否有助于檢測，發(fā)現(xiàn)此時的檢測結果不一致。研究人員認為，或許是由于使用自動RNA提取工作站時，RNA稀釋緩沖液中存在Tris或EDTA所致，這可以通過調(diào)整所用緩沖液的濃度來優(yōu)化。

RT-LAMP 63°C下溫育30分鐘可獲最佳擴增結果

在Michael B Chancellor團隊帶來的報告中，研究人員使用由COVID-19武漢-湖-1（Wuhan-Hu-1）完整基因組（MN908947）的核苷酸2941-3420設計的COVID-19 PCR標準，對幾種引物、溫度范圍（57-65°C）和孵育時間（15-45分鐘）進行了檢測，確定了RT-LAMP的最佳條件。在63°C下溫育30分鐘可獲得最佳擴增結果。

//doi.org/10.1101/2020.02.19.20025155

研究人員對COVID-19、MERS、BtCoV以及MHV病毒進行了系統(tǒng)特異性測試，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)僅對COVID-19的樣本有反應，使用人體血清、尿液、唾液、口咽拭子和鼻咽拭子均可成功地完成RT-LAMP。

從左至右分別為血清、尿液、唾液、鼻咽拭子、口咽拭子的檢測結果

另外，研究人員還將RT-LAMP引物的序列與SARS和與感冒相關的冠狀病毒的序列進行了比對，結果發(fā)現(xiàn)這些冠狀病毒與RT-LAMP引物存在27-54%的核苷酸不匹配，這表明它們不可能檢測出RT-LAMP陽性結果。考慮到病毒可能發(fā)生突變，研究人員還檢查了RT-LAMP引物是否與來自其他地點的27個不同COVID-19分離株存在不匹配現(xiàn)象，結果發(fā)現(xiàn)不匹配度為0。

RT-LAMP引物與其他冠狀病毒的比對結果

盡管這項研究存在一些局限，比如COVID-19是生物安全級別，由于無法直接檢測相關病毒而使用了來自這些病毒相同區(qū)域的核苷酸寡核苷酸，但是這些實驗確實證明了該方法的可行性以及對COVID-19的特異性，對于潛在感染者的篩查和病毒檢測具有很大的價值。

這兩項研究旨在尋找到比RT-qPCR檢測更加快速、準確且簡單易上手的病毒檢測方法，這些方法對于社區(qū)和普通人群檢測是否感染病毒具有重要意義。